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转基因作物检测识别方法

作者:新农业 来源:北京节点 时间:2010年12月31日 点击:次 【字体: 】【关闭窗口

  转基因作物,是指利用分子生物学技术将某些生物的基因转移到其他物种中,使遗传物质得到改造的生物,兼具高产优质、多抗等诸多优点。由于目前尚缺乏科学依据证明转基因作物及产品的安全性,对人类健康和环境潜在的风险已引起广泛关注和忧虑。如何准确检测和识别转基因作物及其产品,也成为人们关注的热点。
  1.生物表型检测法 将待检测识别的种子样品在特定的培养基上培养成幼苗,观察幼苗是否具有转基因的特定性状,以此区分转基因和非转基因幼苗。如耐除草剂的转基因幼苗在除草剂处理的培养基上可以正常生长,而非转基因幼苗则受伤害或死亡,从而区分出耐除草剂的转基因幼苗。该方法的优点是可利用实验室现有的设备和条件,成本低廉,不仅可以测定识别转基因产物,而且可判断其活性。但其缺点是只能测定活的发芽种子,不同的转基因性状需单独测定,且需要的时间较长。
  2.PCR检测法
  定性PCR测定法:迄今,最好的定性转基因种子分析方法是利用PCR测定导入作物植株基因的特定DNA序列是否存在。PCR可对插入两个已知DNA序列之间的特定 DNA序列进行特别和灵敏的扩增(多重)。通常,导入的基因结构(基因卡盒)由3部分构成:启动子、结构基因、终止子。在测定前,至少应该知道这3种中的任何1种,PCR就能用于测定其中任何一种基因,或者来自启动子和终止子DNA标记。PCR基本测定主要包括3个步骤:①、DNA提取和纯化。②、插入DNA的PCR扩增。③、PCR扩增产物存在的电泳确认。每个步骤均会影响测定结果的可靠性和灵敏度,因此全部3个程序都应在最佳状态下操作。
  定量PCR测定法:定量PCR测定有几种方法。主要有:①、竞争PCR,根据目的序列合成一种突变的DNA序列作为竞争模板,竞争模板与目的序列十分相似,可共用一套引物,根据扩增后这两种DNA的含量和已知的竞争模板起始DNA浓度,确定目的模板的起始DNA浓度。②、实时定量PCR,是在定性PCR基础上发展起来的核酸定量技术, 1996年由美国Applied biosystems公司推出,他是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
  该技术不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。该方法不需进行电泳,计算机将直接记录和告知结果。这种测定法能测出作物遗传材料里1个或几个基因拷贝,这是该测定方法的重要优点。但其主要缺点是花时间(需2-3天),并且成本高,PCR容易出现假阳性结果。还有每个性状需分开测定。到目前为止,由于转入基因和作物的种类繁多,尚难有统一的转基因种子检测标准方法。
  3.特异蛋白质检测法 包括酶联免疫检测和横向侧流条测定。
  酶联免疫(ELISA)检测法:一种免疫化学测定,即对遗传改良作物导入基因所产生高度特殊蛋白质的抗体的测定,可定性和定量测定种子样品所提取的转基因蛋白质。方法是将转基因蛋白质的抗体吸附在ELISA微孔板上作为固相,然后将从种子样品提取的蛋白质溶液加到微孔板,温育使抗体与靶蛋白联合,然后将微孔板进行洗涤。再将用于测定抗体与转基因蛋白质之间反应的第2个蛋白质抗体加入微孔板。第二抗体与酶偶联的作用可形成一种检测信号的标记,若存在转基因蛋白质可形成一种颜色产物,这就可用分光光度测定,或肉眼确定。利用已知浓度转基因蛋白质标准曲线和阴性对照与样品比较就可实现定量测定。查对预先制备已知浓度靶蛋白的标准曲线,就可估测转基因蛋白质数量。
  ELISA的优点是要比PCR省成本,且比PCR和生物表现型测定快。包括样品准备(种子样品磨碎和转基因蛋白质提取)时间在内数小时就可获得结果,并高度专化,分析样品仅需简单的准备。但是变性蛋白质(如食品加工所引起变质)由于不能与抗体结合而引起测定困难或导致假阴性。ELISA与PCR方法比,较少出现假阳性的风险。由于ELISA不能判别不同转基因之间不同表达形式和类型,因此每个性状需要分开测定。
  横向侧流条测定法:一种快速稳定的定性测定,可检查转基因蛋白质是否存在。其方法是利用试剂盒的带有抗体的纸条或塑料浆片直接浸一下样品提取液。如果样品提取液中存在转基因蛋白质,试纸上抗体与转基因蛋白质之间就会发生反应,引起横向流式纸条颜色发生变化,从而确定转基因蛋白质的存在。
  4.转基因产品检测芯片法 将当前通用的报告基因、抗性基因、启动手和终止子的特异片段(靶片段)固定在玻片上制成检测芯片。将从待检样品中提取的DNA扩增、标记后与检测芯片进行杂交,杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析判断。该技术具有如下特点:①、选择检测的报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记,通常是在离体条件下易于检测的酶或发光蛋白,目前较为常用的有Gus基因和Gfp基因。抗性基因可以赋予转化细胞抵抗筛选抗生素的能力,常用的抗性基因为Kan抗性基因、Hgy抗性基因。目前转基因过程中使用的基因构件主要以来源于花椰菜花叶病毒CaMV35S启动手、CaMV35S终止子和Nos终止子。将这些具有代表性的探针集合于基因芯片中作为检测靶点,使该转基因作物检测芯片具有一定的代表性。②、综合了PCR和分子杂交的优点,用量少,快速而且准确。③、芯片具有高密度、高通量的优点,可同时检测报告基因、抗性基因、启动子和终止子,非常适合于转基因作物及加工品的检测,具有广阔的发展应用前景。④、检测结果直接由计算机分析软件进行处理,使得结果更加科学、准确。

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